Nueva reacción en cadena de la polimerasa múltiple para el diagnóstico específico de especies implicadas en la candidiasis humana

Introduction: Candidiases is a group of opportunistic infections caused by yeasts belonging to the genus Candida. Candida albicans is the most prevalent species in both superficial and deep infections, however, the clinical importance of non-albicans Candida has increased during the last decade, driving an urgent need for diagnostic tests that allow for species-level resolution and selection of the optimum therapeutic approach.Objective: To design and to optimize a new multiplex PCR assay for the simultaneous identification of the five most relevant species of Candida involved in human candidiasis etiology.Materials and methods: For primers design, the physical and thermodynamic restrictions that affect multiplex PCR performance were analyzed using Gene Runner and Mult-PSOS. As templates, the internal transcribed region 2 (ITR2) was selected for C. albicans (AJ249486.1), and topoisomerase II (TOPII) for C. parasilopsis (AB049144.1), C. krusei (AB049139.1), C. tropicalis (AB049141.1), and C. guillermondii (AB049145.1). We used ATCC strains of all these five species and clinical isolates as templates.Results: We designed ten oligonucleotides for the simultaneous amplification of the Candida species. The electrophoresis band profile was: C. albicans (206 bp), C. guillermondii (244 bp), C. tropicalis (474 bp), C. parasilopsis (558 bp), and C. krusei (419 bp). Conclusion: The new multiplex PCR assay designed in this study allowed a simultaneous and efficient amplification of the amplicons corresponding to the five species of Candida under study, with an adequate resolution in standard agarose gel.Introducción. Las candidiasis son un grupo de infecciones oportunistas causadas por levaduras del género Candida. Candida albicans es la especie de mayor prevalencia en las infecciones superficiales y profundas. Sin embargo, en la última década, la frecuencia de especies diferentes a C. albicans ha aumentado y, por ende, su relevancia clínica, lo cual exige la utilización de técnicas diagnósticas que permitan su detección y el tratamiento adecuado de los pacientes afectados.Objetivo. Diseñar y optimizar una técnica de reacción en cadena de la polimerasa múltiple (PCR múltiple) considerando parámetros termodinámicos para la detección simultánea de cinco especies de Candida relevantes en la etiología de la candidiasis humana.Materiales y métodos. Para el diseño de los cebadores se consideraron restricciones físicas y termodinámicas que afectan la PCR múltiple, usando el programa Gene Runner y la herramienta Mult-PSOS. Como plantillas se utilizaron la región transcrita interna 2 (ITS2) (AJ249486.1) para C. albicans y la topoisomerasa II (TOPII) para C. parasilopsis (AB049144.1), C. krusei (AB049139.1), C. tropicalis (AB049141.1) y C. guillermondii (AB049145.1), y como moldes, extractos de ADN total obtenidos de cepas ATCC y de aislamientos clínicos de las especies de Candida.Resultados. Se diseñaron diez cebadores para la amplificación simultánea de las especies de Candida. Se obtuvo el siguiente patrón de bandas: C. albicans (206 pb), C. guillermondii (244 pb), C. tropicalis (474 pb), C. parasilopsis (558 pb) y C. krusei (419 pb).Conclusión. El ensayo diseñado de PCR múltiple permitió la amplificación simultánea y eficiente de todos los amplicones correspondientes a las especies estudiadas de Candida, así como su adecuada resolución en gel de agarosa al 1,3 %

Diseño y utilidad de un protocolo de PCR múltiple mediante el análisis de regiones microsatélites para la diferenciación de aislamientos clínicos de Candida parapsilosis sensu stricto

205 p.La tipificación molecular de regiones microsatélites (STR), es una herramienta de genotipado queposibilita el estudio de las relaciones filogenéticas entre diferentes aislamientos de microorganismos, conaplicaciones muy diversas en epidemiología y microbiología molecular como puede ser la investigaciónde brotes asociados a infecciones (sean nosocomiales o comunitarias) para identificar los posiblesmecanismos de transmisión de las mismas en la población.El presente trabajo de Tesis Doctoral pretende avanzar en la utilidad y aplicabilidad de la genotipadomediante STR de la levadura Candida parapsilosis sensu stricto, desarrollando y validando un nuevoprotocolo de detección múltiple con un esquema de amplificación touchdown, adaptando el protocolosingleplex original publicado por Sabino et al. en 2010. Durante la etapa de validación se estudiaron laeficacia (utilizando cepas de referencia) como la efectividad (empleando aislamientos clínicos deCandida parapsilosis sensu stricto obtenidos de pacientes con candidemia asociada a dispositivosintravasculares) del nuevo método. Para completar dicho análisis se valoró la concordancia del nuevométodo frente al de referencia y se analizó del poder discriminativo de dicha técnica mediante laestimación de cuatro parámetros (PIC, índice de Simpson, heterocigosidad estimada y la entropía).Los resultados obtenidos estimaron unos valores de sensibilidad y especificidad del 100%, con unosintervalos de confianza al 95% (IC95%) entre 0,158 - 1, y 0,753 ¿ 1 respectivamente. Asimismo, laconcordancia entre ambas técnicas (nueva y original) fue perfecta (índice Kappa: 1 IC95%) lo quegarantiza que el método optimizado es equivalente al protocolo original, permitiendo el acortamiento derealización de la técnica hasta la obtención de los resultados, permitiendo su simplificación de la técnica yabriendo la posibilidad de su automatización. Por último, cabe resaltar que el nuevo método, permitióidentificar de manera más fiable las candidemias relacionada a catéter poder establecer relacionesfilogenéticas entre las muestras tanto de sangre como de catéter en función de su genotipo y no sólo de suespecie tal y como viene haciéndose en la práctica clínica. Por este motivo, la técnica descrita y propuesta en el presente trabajo puede contribuir a la mejora del diagnóstico, tratamiento y manejo de lascandidiasis invasivas causadas por Candida parapsilosis sensu stricto

Diseño y utilidad de un protocolo de PCR múltiple mediante el análisis de regiones microsatélites para la diferenciación de aislamientos clínicos de Candida parapsilosis sensu stricto

205 p.La tipificación molecular de regiones microsatélites (STR), es una herramienta de genotipado queposibilita el estudio de las relaciones filogenéticas entre diferentes aislamientos de microorganismos, conaplicaciones muy diversas en epidemiología y microbiología molecular como puede ser la investigaciónde brotes asociados a infecciones (sean nosocomiales o comunitarias) para identificar los posiblesmecanismos de transmisión de las mismas en la población.El presente trabajo de Tesis Doctoral pretende avanzar en la utilidad y aplicabilidad de la genotipadomediante STR de la levadura Candida parapsilosis sensu stricto, desarrollando y validando un nuevoprotocolo de detección múltiple con un esquema de amplificación touchdown, adaptando el protocolosingleplex original publicado por Sabino et al. en 2010. Durante la etapa de validación se estudiaron laeficacia (utilizando cepas de referencia) como la efectividad (empleando aislamientos clínicos deCandida parapsilosis sensu stricto obtenidos de pacientes con candidemia asociada a dispositivosintravasculares) del nuevo método. Para completar dicho análisis se valoró la concordancia del nuevométodo frente al de referencia y se analizó del poder discriminativo de dicha técnica mediante laestimación de cuatro parámetros (PIC, índice de Simpson, heterocigosidad estimada y la entropía).Los resultados obtenidos estimaron unos valores de sensibilidad y especificidad del 100%, con unosintervalos de confianza al 95% (IC95%) entre 0,158 - 1, y 0,753 ¿ 1 respectivamente. Asimismo, laconcordancia entre ambas técnicas (nueva y original) fue perfecta (índice Kappa: 1 IC95%) lo quegarantiza que el método optimizado es equivalente al protocolo original, permitiendo el acortamiento derealización de la técnica hasta la obtención de los resultados, permitiendo su simplificación de la técnica yabriendo la posibilidad de su automatización. Por último, cabe resaltar que el nuevo método, permitióidentificar de manera más fiable las candidemias relacionada a catéter poder establecer relacionesfilogenéticas entre las muestras tanto de sangre como de catéter en función de su genotipo y no sólo de suespecie tal y como viene haciéndose en la práctica clínica. Por este motivo, la técnica descrita y propuesta en el presente trabajo puede contribuir a la mejora del diagnóstico, tratamiento y manejo de lascandidiasis invasivas causadas por Candida parapsilosis sensu stricto

Clonación y caracterización de una hidrofobina de clase II (CaHPB) de Candida albicans

RESUMEN Las hidrofobinas son una familia de proteínas fúngicas hidrofóbicas de secreción, de pequeño tamaño molecular, que exhiben capacidad para autoensamblarse y para unirse a una interfase hidrofílica/hidrofóbica formando una película anfipática (Wessels, 1997). Son proteínas que se dan exclusivamente en hongos miceliares, se caracterizan por presentar ocho residuos de cisteína conservados en sus secuencias (Wessels, 1994, 1997) que forman puentes disulfuro intramoleculares (De Vries et al., 1993), y están implicadas en la formación de estructuras aéreas y en la unión de las hifas a estructuras hidrofóbicas formando agregados. Estas proteínas poseen gran importancia en los pasos iniciales de la patogénesis fúngica y también son fuentes potenciales para su uso en aplicaciones biomédicas (Wessels, 1997). En este trabajo se describe por primera vez en el hongo dimórfico, patógeno oportunista, Candida albicans, la caracterización de una especie perteneciente a esta familia de proteínas. Mediante el inmunorrastreo de una genoteca de expresión con un anticuerpo policlonal específico de la forma micelial de C. albicans (mPAb), se ha aislado, clonado y caracterizado un nuevo gen de este hongo, al que se ha denominado CaHPB. Dicho gen contiene un posible marco abierto de lectura que codifica para una proteína de 250 aminoácidos (CaHpbp) con un peso molecular de 25.173 Da. El análisis informático de la secuencia reveló la existencia de una región de unos 115 aminoácidos que contiene ocho restos de cisteína localizados en posiciones altamente conservadas, así como de un péptido señal de secreción y de un posible motivo tipo GPI, características compartidas con otras proteínas de la pared celular de C. albicans parcialmente caracterizadas como son Rbt5p y Csa1p/Wap1p. Los ensayos de inmunofluorescencia con un anticuerpo policlonal monoespecífico generado frente a un dominio inmunogénico de la proteína CaHpbp (PAb anti-CaHpbp) reveló que esta molécula se encontraba presente en la superficie celular de C. albicans, mayoritariamente en la forma micelial del hongo. El análisis mediante inmunotransferencia de diferentes extractos obtenidos tanto de paredes celulares aisladas como de células intactas, utilizando el PAb anti-CaHpbp como sonda, indicó que la proteína CaHpbp es secretada al medio extracelular, encontrándose asociada a la superficie de las células del hongo mediante interacciones de tipo no covalente. El marcaje con cisteína radiactiva permitió cuantificar la eficacia de diferentes agentes para solubilizar la especie CaHpbp, encontrándose que el SDS al 1% a pH 9 y el etanol al 60% eran los tratamientos que tenían mayor capacidad de extracción. La especie CaHpbp mostró capacidad para interaccionar con micelas de aceite en una interfase hidrofílica/hidrofóbica de agua y aceite, formando en la superficie de las mismas una capa detectable mediante inmunofluorescencia con el PAb anti-CaHpbp, que podría representar una membrana anfipática. La molécula CaHpbp presente en el medio de cultivo también exhibió la propiedad de adsorberse a la superficie de microesferas de vidrio. Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que la especie CaHpbp se trata de una hidrofobina de clase II, moléculas de secreción que hasta el momento no se han identificado en C. albicans, aunque sí en otras especies de hongos patógenos. CaHpbp se expresa in vivo, como se deduce de los resultados de la detección inmunohistoquímica en los cuales, se observa la expresión de esta molécula en células de C. albicans presentes en muestras de tejidos obtenidas por necropsia y biopsia de pacientes con candidiasis sistémica y/o superficial. Estas observaciones sugieren que la especie CaHpbp podría tener un papel como factor de virulencia en este hongo. __________________________________________________________________________________________________In this work, we have cloned and characterized a class II hydrophobin-like molecule in the opportunistic pathogenic fungus Candida albicans, which exhibits all the characteristics previously described for this type of secretory proteins in other fungal species. Hydrophobins are a small secreted fungal proteins that self-assemble at hydrophilic/hydrophobic interfaces into amphipathic films thereby changing the nature of surfaces (i.e., hydrophobic surfaces become hydrophilic, while hydrophilic surfaces become hydrophobic) and are among the most surface-active biosurfactants known. This attribute can be used to introduce hydrophobic foci on the surface of hydrophilic supports where hydrophobins are attached by covalent binding in response to the environment. Hydrophobins are characterized by the presence of eight conserved cysteine residues that from four disulphide bridges and by a typical hidropathy pattern. Hydrophobins have been classified into two classes, class I and class II hydrophobins. Apart from eight conserved cysteine residues, the amino acid sequences between and within both classes have diverged considerably, and this is reflected in the biophysical properties of these proteins. For instance, assemblages of class I hydrophobins are highly insoluble and only can be dissolved by treatment with formic acid or trifluoroacetic acid, while those of class II hydrophobins only can be dissolved by SDS or ethanol. The properties of hydrophobins make them interesting candidates for use in a wide range of medical and technical applications. Each application has its own requirements, which may be met by using specific natural variants of hydropnobins or by modifying hydrophobins chemically or genetically. Applications also require high production systems for hydrophobins. In this respect, filamentous fungi that naturally secrete hydrophobins into the medium seem to be the hosts of choice. They have been shown to be important in many morphogenetic processes, including sporulation, fruit body development, and infection structure formation. The characterization for the first time of a molecule of this nature in C. albicans may open new therapeutic and diagnostic approaches for the management of candidiasis, since hydrophobins most likely may be related with virulence (allowing the fungal cells to interact better with host tissues during infection) and these kind of fungal moieties are not synthesized by animal cells

Caracterización de aislamientos atípicos de Candida dubliniensis

241 p. : il., gráfLas especies del género Candida son hongos oportunistas que viven en equilibrio con el huésped. A veces, factores tanto endógenos como exógenos alteran este equilibrio y permiten su conversión en especies patógenas, favoreciendo de este modo la infección en humanos. Candida dubliniensis, es una especie identificada recientemente cuya patogénesis se asocia principalmente con la candidiasis oral en pacientes con VIH. El aumento del número de aislamientos clínicos de C. dubliniensis hace necesaria su correcta identificación para facilitar la instauración de pautas terapéuticas apropiadas. Sin embargo, en muchas ocasiones, la identificación de C. dubliniensis en muestras clínicas resulta dificultosa debido a la presencia más frecuente de C. albicans, especie con la que está íntimamente relacionada, compartiendo la mayoría de sus características para la identificación. En esta tesis se estudiaron 477 aislamientos clínicos del género Candida. Nueve aislamientos quedaron sin identificar debido a que presentaban un perfil indefinido entre las especies de C. albicans y C. dubliniensis. Con el objeto de identificar éstas cepas, a las que denominamos ¿atípicas¿, se utilizaron diversas técnicas fenotípicas, inmunológicas y genotípicas que permiten discriminar entre estas dos especies de Candida. Éstos aislamientos fueron correctamente identificados como C. dubliniensis con las técnicas de biología molecular. Tres de las cepas atípicas de C. dubliniensis, mostraron dos características fenotípicas diferentes a las descritas para esta especie: la incapacidad para formar clamidosporas y la falta de reconocimiento por el anticuerpo monoclonal (12F7-F2) de la prueba comercial Bichro-Dubli Fumouze®, altamente específico para esta especie. Estos tres aislamientos atípicos de C. dubliniensis presentaban bajos niveles de expresión de varios genes esenciales necesarios para la inducción de clamidosporas, pudiendo ser una de las causas de la incapacidad para formar clamidosporas de estas cepas. Esta característica convierte a estas 3 cepas atípicas de C. dubliniensis en un posible modelo para el estudio de procesos morfogenéticos, como es la formación de clamidosporas. La falta de reconocimiento con el anticuerpo monoclonal se debía a que los 3 aislamientos atípicos de C. dubliniensis no expresaban el antígeno específico del anticuerpo monoclonal en la superficie de la célula, sino en zonas profundas de la pared celular. Este comportamiento explicaría la incapacidad de estas cepas para aglutinar las partículas de látex sensibilizadas con el anticuerpo en la prueba comercial Bichro-Dubli Fumouze®

Desarrollo de un sistema de PCR en tiempo real para la cuantificación del número de copias de ADN de "Brucella Mellitnesis" en sangre de pacientes con Brucelosis

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Dpto. Medicina Interna. Fecha de lectura: 25 de Septiembre de 2009

Identificación molecular de especies de candida en pacientes quemados

Medical histories of 36 burned patients with documented fungal infection,\nadmitted to the Intensive Care Unit of the Hospital Municipal de Quemados del Gobierno\nde la Ciudad de Buenos Aires between January 2011 and December 2014, were analyzed.\nA total of 52 species of Candida were identified by conventional and molecular methods\nfrom the culture collection stored at -20 ºC at the Laboratory of Hospital de Quemados in\nthe patients studied. The mean hospitalization period was 46.7 days, ranging from 9 to\n218 days. They belonged to females 63.9% (n = 23) and 36.1% male (n = 13). The burned\nbody surface area was estimated at 31-50% in 33.3% of the patients (p=0.03). This\npercentage was observed among the higher age group (59 years of age). Instead, patients\nin the group with a mean age of 19 years suffered burns affecting 71% - 100% of their\nbody surface area. With regard to burn depth, fourth-degree burns affected 69.4% of the\npatients, which indicates the seriousness of the injuries in the patients studied. A total of\n75% of the patients showed burns in different locations (torso, face, lower and upper\nlimbs) and only 25% showed injuries only on the lower limbs, upper limbs or torso. The\ncausative agents of burns were: combustible substances (alcohol, gasoline, explosion):\n41.7%, direct fire: 25%, heaters: 13.9%, water: 16.7% and lastly, electricity: 2.8%. It is\nremarkable that in those cases in which the burn causative agent was a combustible\nsubstance, alcohol was the prevalent agent. When studying causative agents in relation to\nage, burn injuries by fire or heaters were found mainly older patients. Conversely, burns\ncaused by alcohol, combustible substances and electricity were reported on younger\npatients. When studying causative agents in relation to sex, alcohol was found to be the\nprevalent element in females. This higher rate for women is associated with the fact that the causative agents of the burn injury are alcohol and direct fire, according to medical\nhistory including injuries by a close third party. They are the current causes of the\nfemicides reported in our country in women under 40 years of age. Electrical burns and\ngasoline burn injuries were affected males exclusively.When analyzing the correlation\nbetween the burned surface area and the cause (combustible substances vs. other agents),\nit was found that causes other than combustible substances generate smaller burn injuries\n(p= 0.01). However, second-degree burns were observed when the agent was a\ncombustible substance (alcohol, gasoline or explosion) (p=0.03), as a result of a deeper\nburn.Fifty per cent of the burned patients showed inhalation injuries (SII), with both\ncombustible substances and fire as causative agents of the burn injury. A central line was\nrequired in 88.9% of the burned patients. Femoral lines were used in 90.6% and upper\nlines (subclavian and/or jugular lines), in 9.4%. The mean number of lines used per\npatient was 5.8. Orotracheal intubation and tracheostomy were performed in 72.2% and\n41.7% of the patients, respectively. A total of 91.7 % of the patients underwent surgical\ntreatment (escharectomy: 100%, escharotomy: 42.4%, fasciotomy: 54.5% and limb\namputation: 6.1%) while 8.3% of the patients did not undergo any surgical treatment\n(only wound lavage). Following surgical treatment and, after reaching viable tissue, the\nwound was covered with skin grafts. Autograft was performed in 97.2% of the patients,\nshowing firm adherence to the underlying tissue in 75% of the cases. In twenty-five per\ncent of the unsuccessful cases, the mortality rate was 100% (p< 0.01), the main cause\nbeing the septic shock. Inotropes were required in 72.2% of the cases and anti-fungal\ndrugs in 91.7%. A total of 58.8% were initially treated with Fluconazole. The rest of the\ncases were treated with Amphotericin B Liposomal. Death occurred in 38.8% of the patients, its rate being higher among patients over 65 years of age (p= 0.018), on\ninotropes (noradrenaline) (p < 0.001), those patients suffering inhalation injury (p= 0.04),\nthose who had undergone fasciotomy (p=0.04) and those with a history or in a high-risk\ngroup (p = 0.002). Infection by bacteria occurred in 100% of the burned patients, the\nmicroorganisms being: Gram-negative bacteria such as multiresistant Acinetobacter\nbaumannii, Pseudomonas aeruginosa and carbapenemase-producing (KPC) Klebsiella\npneumoniae. Among Gram-positive bacteria, the most prevalent was methicillin-resistant\nS. Aureus (MRSA). The mean time of the onset of bacterial infections was 4 days\nfollowing admission to the Intensive Care Unit. A total of 38.9% of the patients had an\nAPACHE II score of 31-40 while 8.3% had a score of 41-46. A total of 77.7% showed a\nCandida score of 3.Fungal infections are a major cause of morbi-mortality in burned\npatients since they are ideal hosts for opportunistic infections. The incidence of fungal\ninfection was 39.3 for every 1,000 burned patients. On average, the cases of Candidiasis\noccurred after 21.4 days of the admission to the intensive care unit (1-3 weeks).The most\nfrequently isolated yeast was C. albicans in all samples analyzed (wound biopsy samples,\nurocultures, blood cultures, tracheal aspirate cultures, catheter tip cultures). Thus, C.\nalbicans amounted to 53.8%, C. tropicalis to 23.1%, C. parapsilosis sensu stricto\nto13.5%, C. krusei to 5.8%, C. glabrata and C krusei to 1.9 % each. C. albicans was the\nprevalent species in blood cultures, followed by C. parapsilosis. In the urocultures, nonalbicans\nCandida species surpassed C. albicans. Patients with positive blood cultures for\ncandidaemias showed higher mortality than those with negative blood cultures for\ncandidaemias, with no statistically significant difference (p= 0.091). Molecular\nidentification (HWP1 gene amplification by PCR) and microbiological identification agreed with C. albicans and C. dubliniensis. For some C. albicans isolates, the\namplification produced two fragments of DNA. The smaller fragment (941 bp) was\nproduced by the HWP1 gene and the larger fragment resulted from the RBT1 gene partial\namplification by a non-specific primer binding but the identification of C. albicans was\nconfirmed by clone sequencing. Molecular identification of isolates was required for the\nidentification of C. parapsilosis and C. glabrata as C. parapsilosis sensu stricto and C.\nglabrata species complex. For C. glabrata species complex, PCR reaction for RLP31\ngene, which codes for a 60S ribosomal protein, determined the absence of C. bracarensis\nand C. nivariensis, and the presence of C. glabrata. Molecular identification of C.\nparapsilosis species complex by specific primers for each of these complex species by\nsequencing of ITS1 and ITS2 regions of rDNA enabled the identification of C.\nparasilopsis sensu stricto. C. orthosilopsis and C. metapsilosis were not detectedFil: Badino Varela, María Gabriela Mercedes. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, ArgentinaSe analizaron las historias clínicas de 36 pacientes quemados con infección\nfúngica documentada, internados durante el período comprendido entre enero 2011 y\ndiciembre del 2014 en el área de internación de Terapia Intensiva del Hospital Municipal\nde Quemados del Gobierno de la Ciudad de Buenos Aires. Se identificaron por\nmicrobiología convencional y molecular a 52 especies de Candida provenientes de la\ncolección de cultivo que el Laboratorio del Hospital de Quemados conserva a -20 ºC,\ncorrespondiente a los pacientes estudiados. La internación de los pacientes fue promedio\n46,7 días, con un rango entre 9 y 218 días. Pertenecieron al sexo femenino el 63,9 % (n=23) y al masculino 36,1 % (n=13). Se observó un predominio de una extensión de la\nsuperficie corporal quemada entre 31 y 50 % en el 33,3 % de los pacientes (p=0,03). Esta\nse presentó en el grupo etario de mayor edad (59 años), en tanto entre el 71 y 100%, la\nedad promedio fue de 19 años. Al considerar la profundidad de la quemadura\nespecíficamente la de grado 4, se observó en el 69,4 % de pacientes, esto marca la severa\ngravedad de las lesiones en los pacientes estudiados. El 75 % de los pacientes\npresentaron una combinación de sitios quemados (tronco, cara, miembros inferiores y\nmiembros superiores) y solo el 25 % exhibieron lesiones en miembros inferiores,\nsuperiores o en tronco. Los agentes causantes de la quemadura fueron: combustible\n(alcohol, nafta, explosión) 41,7 %, fuego directo 25,0 %, estufa 13,9 %, agua 16,7 % y\npor último electricidad 2,8 %. Debemos destacar que cuando el agente causal de la\nquemadura resultó el combustible, el alcohol fue el agente de mayor prevalencia. Al\nrelacionar a los agentes causales y la edad observamos que cuando la fuente fue la estufa\ny el fuego las quemaduras se presentaron a una mayor edad promedio, en tanto que\ncuando lo fue el alcohol, combustible y electricidad se presentaron a menor edad. Al\nanalizar los agentes causales y el género, podemos apreciar que el elemento alcohol, fue\nprevalente en el sexo femenino. Esta superioridad femenina, se relaciona con el agente\ncausante alcohol y fuego directo como causa de la quemadura, según figura historia\nclínica por lesiones de un tercero con vínculo afectivo. Son, en parte las causas actuales\nde femicidios, que se informan en nuestro país y que se presentan en menores de 40 años.\nLa quemadura por electricidad y nafta furon exclusivas del sexo masculino.Al relacionar\nla superficie quemada y la causa (combustible vs. otros agentes), se encontró que causas\nno combustibles ocasionan una menor superficie quemada (p= 0,01), en tanto el grado 2 se presenta cuando el agente fue combustible (alcohol, nafta, explosión) (p=0,03), como\nresultado de una mayor profundidad de la quemadura. El 50 % de los pacientes quemados\npresentaron LIH, implicados el combustible y el fuego como agente de la quemadura. Se requirió\nde vías centrales en el de 88,9 % de los quemados. La vía femoral se usó en el 90,6 % y el 9,4 %\nlas vías superiores (subclavia y/o yugular). El promedio de vías utilizadas en cada paciente fue de\n5,8. La intubación orotraqueal y la traqueotomía se practicaron en el 72,2 % y 41,7 %,\nrespectivamente. Se practicó tratamiento quirúrgico en el 91,7 % de los pacientes (escarectomías\n100%, escarotomías 42,4%, fasciotomías 54,5% y amputación de miembros 6,1%) y sin\ntratamiento quirúrgico (sólo curación con lavados) se encontraron 8,3 % de los quemados. Luego\ndel tratamiento quirúrgico y de obtener un lecho de tejido viable, se procedió a cubrir la herida\ncon injertos de piel. Se les aplicó autoinjerto a 97,2%. El mismo exhibió buena adherencia al\ntejido subyacente en un 75%. En el 25% que no fue exitoso, el porcentaje de mortalidad fue de\n100 % (p< 0,01), cuya causa principal es el shock séptico. El requerimiento de inotrópicos fue del\n72,2 % y de antifúngico del 91,7%. Se inició la terapia con fluconazol en el 58,8% y el resto\nanfotericina B liposomal. La mortalidad ocurrió en el 38,8 % pacientes y se observó que fue\nmayor entre los mayores de 65 años (p= 0,018), con el uso de inotrópico (noradrenalina) (p <\n0,001), con LIH (p= 0,04), en pacientes que se les practicó una fasciotomía (p=0.04) y en el grupo\ncon antecedentes o factores de riegos (p = 0,002). Las infecciones bacterianas estuvieron\npresentes en el 100 % de los pacientes quemados y los microorganismos fueron: bacterias Gram\nnegativas multirresistentes como Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa y\nKlebsiella pneumoniae productora de carbapenemasa (KPC). Entre los Gram positivos, S. aureus\nmeticilinoresistente (SMR) fue el más prevalente. El momento de aparición de las infecciones\nbacterianas en promedio fue 4 días post ingreso a la unidad de cuidados intensivos. El 38,9 % de\nlos pacientes presentaron un APACHE II entre 31-40 y el 8,3 % entre 41?46. El Candida score\nfue de 3 en el 77,7 %. Las infecciones fúngicas son una causa importante de morbimortalidad en pacientes quemados, ya que constituyen un huésped ideal para las infecciones oportunistas. La\nincidencia de infección fúngica representó en 39,3 por cada 1000 quemados y las candidiasis se\nprodujeron en promedio a los 21,4 días de ingreso a la unidad de cuidados intensivos (rango 1-3\nsemanas). La levadura de más frecuente aislamiento fue C. albicans en todos los materiales\nclínicos analizados (biopsia de la lesión, urocultivo, hemocultivo, aspirado traqueal, punta de\ncatéter). Asi, C. albican estuvo representada con el 53,8 %, C. tropicalis con el 23,1 %, C.\nparapsilosis sensu stricto 13,5 %, C. kruse 5,8 %, C. glabrata y C. krusei 1,9 % cada una. En los\nhemocultivos, C. albicans fue la especie prevalente, seguida por C. parapsilosis. En el urocultivo\nlas especies Candida no-C. albicans sobrepasaron a C. albicans. Los pacientes con hemocultivos\npositivos (candidemias), presentaron mayor mortalidad que aquellos con candidemias negativas\naunque sin diferencia estadísticamente significativa (p= 0,091). La identificación molecular (la\namplificación por PCR del gen HWP1 coincidió con la microbiológica en C. albicans y C.\ndubliniensis. Existieron aislamientos de C. albicans que la amplificación produjo dos fragmentos\nde ADN. El fragmento de menor (941 pb) tamaño es producto del gen HWP1 y el fragmento de\nmayor tamaño se debió a la amplificación parcial del gen RBT1 por un pegado inespecífico de los\ncebadores, pero se confirmó por secuenciación de ambos clones a C. albicans.Para la\nidentificación de C. parapsilosis y de C. glabrata como C. parapsilosis sensu stricto y C.\nglabrata dentro del complejo de esta última especie, se requirió de la identificación molecular a\nlos aislamientos. En el complejo de C. glabrata a través de la reacción de PCR para el gen RLP31\nque codifica para una proteína ribosomal de 60S determinó la ausencia de C. bracarensis y C.\nnivariensis; y confirmó la presencia de C. glabrata. La identificación molecular de las especies\ndel complejo de C. parapsilosis con cebadores específicos para cada una de las especies de este\ncomplejo derivados de secuencias dentro de la región de ITS1 y ITS2 del rDNA permitió la\nidentificación C. parasilopsi sensu stricto. No se detectó la presencia de C. orthosilopsis y C.\nmetapsilosis.\

Estudio de mecanismos de la inmunidad innata en la patogénesis de la leptospirosis

El trabajo de tesis consta de tres bloques: 1) la caracterización de dos proteínas (BatA y BatB) codificadas en el genoma de Leptospira interrogans; 2) el estudio del rol de los neutrófilos durante la infección con Leptospira interrogans, utilizando un modelo de leptospirosis murina experimental; 3) el análisis de la relación entre el polimorfismo Arg753Gln del TLR2 humano y la leptospirosis.Facultad de Ciencias Exacta

Levaduras del género candida de procedencia clínica. Evaluación de métodos de identificación

Ensayo de muestras de levaduras procedentes de consultas externas y de diferentes áreas de hospitalización del Hospital Universitario de Canarias, durante tres años, así como de cepas remitidas de distintos hospitales para ampliar el espectro de las diferentes especies del género Candida. Se efectúa la siembra para el aislamiento primario de la levadura en el medio de cultivo de Sabouraud y de CHROMagar Candida para comprobar la posibles mezclas de levaduras.Todas las cepas fueron identificadas con el API ID32C (métodos usado como de referencia). Seguidamente, se realizan métodos rápidos de identificación de C. Albicans, como filamentación en suero, y las técnicas comercializadas: Albicans ID2, Bacticard Candida y Chromalbicans. A continuación, se utilizaron las distintas técnicas comercializadas (Microscan Rapid Yeast Identification, Vitek Yeast Biochemical Card, RapID Yeast Plus System, Auxacolor para corroborar o no esta identificación, así como identificar hasta nivel de especie en el caso de resultar negativo el test de filmentación. También se realizaron pruebas de crecimiento a temperaturas y tiempos variables, para lo cual se realizó la siembra de cada una de las cepas en Sabouraud y se incubaron a 30ºC, 37ºC y 42ºC durante 72 h, leyéndose el crecimiento observado cada 24 h. De las muestras estudiadas, independiente de la procedencia orgánica, la mayor frecuencia la presentó C. Albicans (46,6%), seguido de C. Parapsilosis (14,6%), C. Tropicalis (13,3%), C. Glabrata (9,2%) y c. Lusitaniae (3,7%). El resto de las especies se han identificado en una proporción bastante inferior. También se realizó el serotipado a 95 aislados de C. Albicans, encontrándose el serotipo A en mayor proporción(88,4%) frente al serotipo B (11,6%). En cuanto al crecimiento a diferentes temperaturas de incubación y tiempos variables, se observó que a 30 y 37ºC se produce un buen desarrollo de la mayoría de las especies, alrededor de un 90 y 97%, viéndose ralentizado a 42ºC. Así como un mayor crecimiento a las 48h de incubación.La concordancia en el caso del test de filamentación en suero con el API ID 32 fue del 93,8%. Asimismo, la concordancia obtenida en los diferentes métodos comercializados para C. Albicans fue del 91,5% para Chromalbicans, 95,2% para el Bacticard Candida y 98,2% para el Albicans ID2. Con respecto a las restantes técnicas para las diferentes especies del género Cándida se observa un índice de concordancia entre el 93,2% del Vitek y el 97,5% del CHROMagar Candida. En conclusión, los resultados muestran una elevada concordancia en los diferentes métodos comercializados con el API ID 32C